摘要本文基于PBS Biotech与GeneFab联合发布的白皮书验证了PBS垂直轮生物反应器的CAR-NK扩增工艺。经0.1L小试参数优化、3L中试对比三种培养模式结果显示灌流工艺可使细胞扩增倍数提升2.6倍细胞杀伤效力优于静态培养且系统线性放大性优异为CAR-NK临床级规模化生产提供数据支撑。关键词垂直轮生物反应器、PBS Mini、CAR-NK、PBS 3L、ATF灌流工艺、补料批培养、PBS垂直轮生物反应器、CAR-NK高密度扩增、工艺放大、批培养、NK细胞扩增批培养、补料和ATF灌流三种工艺方案的CAR-NK扩增验证随着NK细胞免疫疗法在肿瘤、自身免疫病等领域的临床推进如何实现稳定、可放大的临床级细胞扩增成为行业普遍关注的核心问题。传统静态培养体系存在操作繁琐、污染风险高、批培养一致性差、放大难度大等短板难以匹配商业化生产需求。近期PBS Biotech联合GeneFab发布专项白皮书以人外周血来源CAR-NK为研究对象在PBS垂直轮生物反应器体系内系统验证了批培养、补料批培养、ATF灌流三种培养策略的扩增表现并完成从0.1L小试到3L中试的全流程工艺验证为CAR-NK规模化生产提供了实测数据参考。图1.PBS Mini垂直轮反应器系列包括PBS Mini基座和一次性耗材两部分其中耗材有0.1L和0.5L两种规格。一、研究设计覆盖从小试到中试的全流程验证该研究采用经辐照K562滋养层激活、逆转录病毒转导的CAR-NK细胞分别在PBS-0.1 Mini100 mL工作体积与PBS-33 L工作体积垂直轮生物反应器中开展实验。核心评估维度包括搅拌转速、接种密度等关键工艺参数优化批培养、补料批培养、灌流三种培养模式的扩增效率对比细胞活率、凋亡水平、CAR表达、杀伤效力等质量属性评价以及从小试到中试的工艺放大一致性验证。图2.补料批培养与灌流培养体系下NK细胞从活化、扩增至冻存的工艺流程示意图。二、PBS Mini 0.1L小试初步锁定核心工艺参数PBS Mini 0.1L作为低成本缩小模型可快速完成工艺参数筛选降低中试开发风险。研究针对搅拌转速、接种密度两大核心变量开展了系统优化。1. 搅拌转速30–50 rpm为较优区间研究测试了10、30、50、100 rpm四档转速。10 rpm条件下混合效率不足出现明显细胞沉降与团聚扩增受限100 rpm条件下剪切应力提升细胞凋亡比例增加影响细胞健康状态30 rpm和50 rpm可支持稳健细胞扩增其中30 rpm批培养模式下12天扩增倍数可达36倍效果优于10 rpm组。FigureDonorCulture DurationFeeding StrategySeeding Density (cells/mL)Agitation SpeedTotal Viable Cells (D10)Fold Expansion3A/BDA12Batch100×10³10 RPM1.2×10⁸173A/BDA12Batch100×10³30 RPM3.1×10⁸363A/BDA12Batch100×10³50 RPM2.9×10⁸303C/DDB10Batch50×10³50 RPM1.5×10⁸313C/DDB10Batch50×10³100 RPM1.2×10⁸243C/DDB10Batch50×10³50→100 RPM shift1.2×10⁸253E/FDB10Fed-Batch50×10³50 RPM2.5×10⁸503E/FDB10Fed-Batch100×10³50 RPM1.9×10⁸193E/FDB10Fed-Batch250×10³50 RPM4.5×10⁸183E/FDB10Fed-Batch400×10³50 RPM2.5×10⁸13表1.PBS-0.1中参数评估与扩增结果。2. 接种密度低接种密度实现更高扩增倍数研究在补料批培养模式下测试了5×10⁴、1×10⁵、2.5×10⁵、4×10⁵ cells/mL四档接种密度。5×10⁴ cells/mL组扩增倍数较优10天可达50倍随着接种密度升高扩增倍数逐步下降高接种密度下营养消耗更快生长平台期更早出现。综合总细胞产量与工艺效率研究选择1×10⁵ cells/mL作为中试放大的基准接种密度。此外培养基中添加1 g/L Pluronic F-68作为剪切保护剂可进一步降低搅拌过程中的细胞损伤提升培养体系稳定性。图3A-B.30 rpm与50 rpm搅拌转速下的细胞扩增倍数约为10 rpm组的2倍。培养12天后葡萄糖浓度降至约1.5 g/L乳酸浓度升至约1.4 g/L。图3C-D.100 rpm恒速与50→100 rpm变速搅拌条件下终细胞密度相近50 rpm恒速条件下细胞扩增效果较优。10天培养周期结束时葡萄糖浓度降至约2 g/L乳酸浓度升至约0.8 g/L。细胞生长通常在此代谢水平下进入平台期与细胞密度变化趋势一致。图3E-F.50×10³ cells/mL的较低接种密度可实现较高扩增倍数。10天培养结束时50×10³ cells/mL与100×10³ cells/mL接种组的代谢谱特征相近。三、PBS-3L中试补料批培养可明显提升细胞产量基于小试优化参数研究将工艺放大至3L规模并对比批培养与补料批培养两种培养策略。批培养模式为3L全体积起始培养全程不补加培养基补料批培养模式为2L起始培养接种后第3天补加1L新鲜培养基至满体积。实验结果显示补料批培养策略通过补充营养、稀释代谢废物有效延缓生长平台期总细胞产量优于批培养模式。同时0.1L小试与3L中试的细胞生长动力学、代谢趋势高度一致验证了PBS垂直轮反应器的线性放大特性工艺参数可顺利迁移有助于降低放大风险。图4.细胞扩增结果分析图。该组图谱包含非灌流批培养的细胞密度变化曲线、葡萄糖和乳酸浓度变化以及三个培养批次的细胞计数和扩增倍数统计。结果证实相较于批培养模式采用补料批培养换液策略可获得更高细胞产量。代谢数据显示当葡萄糖浓度降至约2.0 g/L、乳酸浓度超过1.0 g/L时细胞生长开始进入平台期这一阈值也为后续灌流工艺的启动时机提供了参考依据。四、ATF灌流工艺扩增产量提升2.6倍为进一步实现工艺强化研究在3L反应器上搭配Repligen ATF2系统开发了灌流培养工艺灌流速率设定为1.5 L/天也就是0.5 VVD。图5.灌流培养操作工艺图谱。图中展示灌流培养批次细胞密度变化、葡萄糖与乳酸代谢浓度变化、细胞收获总量、细胞扩增倍数对比及灌流运行计划。1. 扩增效率大幅提升相较于同供体补料批培养工艺灌流模式下细胞扩增倍数提升2.6倍较高活细胞密度达5×10⁶ cells/mL3L体系单批培养总活细胞量可达1.5×10⁹。2. 细胞质量无明显影响通过凋亡检测验证灌流启动前后细胞健康状态无明显差异健康细胞占比稳定在60%以上说明垂直轮温和流体环境与ATF低剪切截留模式不会对NK细胞造成额外明显损伤。图6.5号灌流培养批次细胞健康状态评估。对灌流启动前后的细胞健康状态进行检测对比结果表明灌流启动前后细胞整体健康水平基本一致。3. 代谢环境更稳定灌流可持续补充新鲜营养并移除乳酸等代谢废物使培养体系的葡萄糖、乳酸浓度维持在稳定区间避免批培养中代谢废物积累导致的生长抑制。研究同时指出以细胞密度和代谢水平作为灌流启动依据比固定天数启动更具经济性可提升培养基利用效率。五、功能验证反应器扩增细胞杀伤效力更优细胞扩增数量之外功能活性是临床价值的核心。研究通过LDH杀伤实验对比了PBS反应器与静态G-Rex培养体系扩增的CAR-NK细胞效力。培养第7天PBS组相对杀伤效力为G-Rex组的1.77倍培养第8天PBS组相对杀伤效力提升至G-Rex组的2.56倍。结果表明垂直轮反应器的动态培养环境不仅能提升细胞产量还有助于维持甚至增强CAR-NK细胞的肿瘤杀伤功能。此外扩增后的细胞CAR表达水平正常经冻存复苏后活性符合要求适配临床制备全流程需求。图7.静态G-Rex培养体系与5号灌流培养批次的细胞相对效力对比。图8.单一供体来源CAR-NK细胞在垂直轮生物反应器中的细胞密度变化。PBS-3与PBS-0.1反应器的补料批培养结果显示二者生长动力学特征一致验证了工艺线性放大的一致性PBS-3反应器中补料批培养与灌流培养的对比表明采用灌流换液策略可有效提升细胞产量。六、总结与展望本次研究系统验证了PBS垂直轮生物反应器在CAR-NK扩增中的可行性与优势。首先垂直轮反应器提供低剪切环境温和流体特性可维持较高细胞活率与功能活性其次0.1L Mini模型的工艺参数可迁移至3L及更大规模线性放大特征有助于降低开发成本再次搭配ATF灌流后细胞产量较补料批培养提升2.6倍最后从实验数据推算80L规模灌流培养下理论总细胞产量可达4×10¹¹可满足多位患者临床治疗剂量需求相关剂量需结合具体临床方案和质量标准判断。同时该白皮书也客观指出目前工艺尚未达到体系上限。通过进一步优化培养参数、采用基于实时代谢的反馈式灌流策略细胞密度与产量仍有进一步提升空间。整体而言这套“垂直轮反应器ATF灌流”的CAR-NK扩增工艺为细胞治疗企业提供了一条可复制、可放大、合规性更强的规模化生产思路。图9.PBS Biotech、GeneFab与Repligen联合发布CAR-NK细胞扩增白皮书相关资料。扩展阅读PBS Biotech垂直轮生物反应器技术资料原文参考文献Mace EM. Human natural killer cells: Form, function, and development.J Allergy Clin Immunol. 2023;151(2):371-385.Wang W, Liu Y, Yang Y, et al. NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development.J Hematol Oncol. 2020;13(1):1-23.Davis BM, Loghin ER, Conway KR, Zhang X. Automated Closed-System Expansion of Pluripotent Stem Cell Aggregates in a Rocking-Motion Bioreactor.SLAS Technol. 2018;23(4):364-373.Jenkins MJ, Farid SS. Human pluripotent stem cell-derived products: advances towards robust, scalable and cost-effective manufacturing strategies.Biotechnol J. 2015;10(1):83-95.Natalie Francis, Joy Aho, Inbar Friedrich Ben-Nun. Scaling up pluripotent stem cell-based therapies - considerations, current challenges and emerging technologies: perspectives from the ISCT Emerging Regenerative Medicine Working Group.Cytotherapy. 2025.Granzin M, Soltenborn S, Müller S, et al. Fully automated expansion and activation of clinical-grade natural killer cells for adoptive immunotherapy.Cytotherapy. 2015;17(5):621-632.Xu S, Hoshan L, Arias E, et al. Effects of Pluronic F-68 on the growth and metabolism of mammalian cell lines in suspension culture.Biotechnology Progress. 2017;33(1):229-239.Iliopoulou EG, Kountourakis P, Kafasi N, et al. A short-term ex vivo NK cell expansion protocol with pH-controlled culture conditions enhances NK cell cytotoxicity against tumor targets.Journal of Translational Medicine. 2010;8:32.Voigt A, et al. Impact of ammonia and lactate on CHO cell culture performance and quality of monoclonal antibodies.Biotechnology Progress. 2012;28(3):721-733.Lamers-Kok N, Panella D, Georgoudaki AM, et al. Natural killer cells in clinical development as non-engineered, engineered, and combination therapies.J Hematol Oncol. 2022;15:164.关于技术来源本文基于PBS Biotech、GeneFab及相关公开白皮书资料曼博生物整理用于科研信息分享、实验参考和CAR-NK临床级规模化扩增工艺理解。PBS垂直轮生物反应器应用涉及CAR-NK细胞来源、K562滋养层激活、逆转录病毒转导、PBS Mini 0.1L小试、PBS-3中试、搅拌转速、接种密度、Pluronic F-68剪切保护、补料批培养、ATF灌流、葡萄糖乳酸代谢、凋亡检测、CAR表达、LDH杀伤实验和冻存复苏等多项变量实际应用前仍需结合具体实验条件进行验证。本文围绕PBS Biotech PBS Mini、PBS-3、垂直轮生物反应器、0.1L与0.5L一次性耗材、CAR-NK高密度扩增、ATF灌流工艺、NK细胞扩增和细胞治疗规模化制造等方向提供产品信息与技术资料支持。本文不作为临床治疗建议仅供科研与工艺开发参考。